Ulica Floriańska w Krakowie to jeden z fragmentów tak zwanej Drogi Królewskiej, biegnącej od zamku na Wawelu na północ kraju. Ze względu na znaczenie tego traktu, zabudowa ulicy istniała już w średniowieczu. Kamienica przy Floriańskiej 41 została zbudowana w XVI wieku i była kilkakrotnie przebudowywana. Ostateczny kształt nadali budynkowi w latach 70. XIX wieku architekt Tomasz Pryliński we współpracy z Janem Matejką – właścicielem domu, wówczas znanym malarzem, związanym z nurtem historyzmu i krakowską Szkołą Sztuk Pięknych (późniejszą ASP w Krakowie).
Jan Matejko urodził się, mieszkał i zmarł w domu rodzinnym przy ulicy Floriańskiej. Mury kamienicy były świadkami jego twórczości, życia rodzinnego i działalności społecznej, w szczególności związanej z badaniem i zabezpieczaniem historycznego dziedzictwa. W ogromnym zasobie pamiątek po artyście znalazła się między innymi kolekcja zabytków z różnych epok oraz rysunkowej dokumentacji miejsc i obiektów historycznych, często traktowanych przez malarza jako szkice do wielkoformatowych płócien, w tym tych, które prezentowane są obecnie w Galerii Sztuki Polskiej XIX wieku w Sukiennicach.
Po śmierci artysty zawiązało się Towarzystwo jego imienia, które postawiło sobie za cel uczczenie osoby wybitnego malarza tworząc muzeum biograficzne jemu poświęcone. Dużym nakładem sił, w wykupionym od rodziny domu zgromadzono drogą zakupów i darów eksponaty związane z postacią Jana Matejki i jego rodziny, prezentując je po raz pierwszy publiczności już w 1898 roku, czyli już pięć lat po śmierci malarza. W 1904 roku Towarzystwo im. Jana Matejki przekazało utworzone przez siebie muzeum biograficzne pod zarząd Muzeum Narodowego w Krakowie. Dziś zbiory Domu Jana Matejki liczą około 6000 eksponatów.
Znajdują się w nich przedmioty codziennego użytku i pamiątki po artyście i jego najbliższych: żonie Teodorze z Giebułtowskich Matejkowej (1846-1896), dzieciach: Tadeuszu (1865-1911), Helenie Unierzyskiej (1867-1932), Beacie Kirchmayerowej (1869-1926), Jerzym (1873-1827) i Reginie (1878-1878). Zbiory obejmują listy, oficjalne dokumenty, pamiątki jubileuszowe, wyrazy uznania, a przede wszystkim prace olejne i rysunkowe, obiekty z kolekcji Matejki, którą gromadził przez całe życie, dzieła innych twórców, fotografie rodzinne oraz wykonane w XIX wieku fotografie obrazów mistrza oraz należący do niego zbiór książek i nut.
Dom Jana Matejki popularyzuje nieznane aspekty życia i twórczości artysty, jak również jego bogate zbiory rzemiosła, tkanin i militariów. Służą temu: stała ekspozycja, która prezentuje zbiory działu Muzeum Dom Jana Matejki, a także wystawy czasowe w oddziale oraz interdyscyplinarna współpraca z ośrodkami muzealnymi w kraju i zagranicą.
Zbiory Jana Matejki zawierają eksponaty, które wiążą się z osobą artysty i jego twórczością. W dużej części jest to kolekcja rzemiosła artystycznego, tkanin, broni i zbiorów etnograficznych, którą artysta gromadził przez całe życie.